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        微芯片電泳在二代測序(NGS)文庫質控的應用

        微芯片電泳在二代測序(NGS)文庫質控的應用



        隨著測序價格不斷降低,NGS的應用現在可以說是如日中天了,市場中主流NGS系統,如Hiseq,Solexa,454等,越來越多的進入到大家的視野中。為了得到良好準確的測序結果,NGS前要求了解測序文庫樣品的尺寸分布和濃度,以提高測序的準備性、減少測序過程中不必要的嘗試、降低測序成本。

        傳統的方法是使用瓊脂糖凝膠電泳獲得文庫的尺寸分布,文庫的濃度信息則是通過實時熒光PCR或分光光度計獲得。這樣的操作需要一系列的步驟、繁瑣費時、效率低下、成本居高不下。

        另外,隨著測序技術的成熟,需要進行質量控制的文庫數量大大增多!

        本文承接上文,繼續介紹微芯片電泳在NGS文庫構建中樣品分析的應用,以期為大家提供一種操作簡單、自動化程度高、高通高、成本可接受的方法。

        分析方法(與實時PCR 的濃度定量結果的比較):

        1、利用SMARTer Ultra Low RNA kit 制備cDNA 擴增產物得到小鼠的TotalRNA

        2、根據Illumina 公司的方法,分享cDNA 擴增產物后,使用TruSeq DNA sample prep kit 制備NGS 文庫

        3、使用微芯片電泳系統及自帶彌散(smear)分析軟件分析同一文庫,同時對濃度進行定量

        4、微芯片電泳系統的濃度定量結果和同一樣品的實時PCR(GVP-9600 qPCR)結果進行比較

        圖2. NGS 流程和MultiNA 文庫質量控制的應用范圍

        結果討論:

        在NGS文庫的質量控制過程中,使用微芯片電泳的smear分析軟件能夠計算出文庫的預計平均大小、濃度和摩爾濃度(下圖)。通過與實時PCR 的定量進行比較,可知MultiNA 的定量濃度定量結果穩定(下表)。

         Library No. MultiNA (nmol/L)  GVP-9600 (nmol/L) Ratio (MultiNA/GVP-9600)
        1 154.6 167.3 92.40%
        2 127.0 145.1 87.50%
        3 54.1 57.8 93.60%
        4 272.4 292.3 93.20%
        5 187.3 226.8 82.60%
        6 207.5 229.3 90.50%
        7 230.3 256.8 89.70%
        8 157.0  181.9 86.30%
          Average 89.475% (CV 4.3 %)

        在小鼠的RNA 測序結果中,也得到了足夠的讀取長度和Index標簽序列的各文庫間穩定的讀取率(下表)。

        簇密度讀取數

        (過濾處理后)

        548 K/mm2

        143.3 M reads

        總讀取數

        ≧Q30 比率

        151.5 M reads

        95.90%

         4 個文庫的讀取率  21.2% - 26.2%(4個文庫/用Index
        標簽序列對1個通道排序:理論值25 %)
           

        注:文庫制備時如果沒有進行PCR,可能無法根據文庫的分布數據得到理想的檢測靈敏度。

        由上述結果可知,不僅可以在MultiNA 的文庫質量控制中確認大小分布,還能夠在常規分析中同時進行定量。使用MultiNA可最多對108 個文庫自動進行電泳和分析。并且,實際操作時間可縮短10~20 分鐘。特別是NGS 文庫有所增加時,將MultiNA應用到文庫質量控制中,可快速簡便地進行質量控制。

        MultiNA微芯片電泳系統進行NGS文庫質量控制的優點:







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