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        細胞劃痕實驗操作教程

              細胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單,經濟實惠的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。這種方法的原理是,當細胞長到融合成單層狀態時,在融合的單層細胞上人為制造一個空白區域,稱為“劃痕”,劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區域使“劃痕”愈合,在一定程度上模擬了體內細胞遷移的過程,是研究細胞遷移的體外實驗中最簡單的方法。

           劃痕實驗中,檢測目標為感染病毒后表達熒光蛋白的目的細胞[不表達熒光蛋白也可以,但是圖片得視覺效果不如表達熒光蛋白] (生長于96孔板中)。用專用的劃痕工具制造劃痕,細胞成像系統識別帶綠色熒光的細胞并拍照(即讀板)。然后通過軟件對同一視野細胞遷移0h和x h(x為實驗細胞合適的遷移時間點[時間太早,劃痕愈合的效果不明顯,時間太長,不同組別的劃痕都愈合完成,組間看不到差異,推薦時間點為0h、8h、16h、24h、36h、48h] )后圖像進行分析處理,計算出實驗細胞在x h的遷移面積。


        96孔細胞劃痕儀

        二、實驗材料

        1.主要試劑

        胎牛血清、基礎培養基、胰酶、PBS

        2. 主要儀器

        生物安全柜、熒光顯微鏡、離心機、CO2培養箱

        三、實驗步驟

        (1)   將處于對數生長期的各實驗組細胞胰酶消化后,完全培養基重懸成細胞懸液,計數;

        吸棄培養基

        PBS清洗

        加入胰酶

        終止消化

        收集細胞

        離心獲取沉淀

        細胞計數儀 (上海吉盛醫學科技有限公司提供  QQ:1711332989

        (2)   根據細胞大小決定鋪板細胞密度(大多數細胞鋪板數設定為50000 cell/well,以次日細胞達到90%以上匯合度為準[細胞鋪的太多,太擠,連原本細胞形態都會看不清。劃的時候,也很容易劃不干凈,而且劃完以后,兩邊會掛有一團團細胞,使兩邊邊界不清晰。不同細胞,形態大小不一,鋪板細胞量自然也就不一樣,想要找出鋪板最佳細胞量,最快捷的方法就是鋪梯度。96孔板,那么多孔,足夠一次鋪好幾個密度梯度了(3萬,5萬,10萬,隨便試) 。37℃、5%CO2培養箱培養,每組3復孔,培養體系為100 μL/孔。

        劃痕鋪板

        鋪板后細胞

        (3)   第二天換低濃度血清培養基.

        次日細胞狀態

        劃痕儀準備一(上海吉盛醫學科技有限公司生產制造  QQ:1711332989

        劃痕儀準備二  (上海吉盛醫學科技有限公司生產制造  QQ:1711332989

        劃痕  (細胞遷移-劃痕實驗工具單頁.pdf

        (4)   使用PBS輕輕漂洗2-3遍[劃完以后,痕中間和培養液中遺落少量細胞,是可以通過清洗去除的(如果太多,就別掙扎了,重新再來吧),有些是已經被劃動了,但沒有完全劃掉,這時候清洗個兩三次,清洗的時候輕拍96孔板,已經被劃動的貼壁不牢的細胞大多數會別洗掉。不過,對于一些本身就容易脫落的細胞,就不能這樣洗了,只能“溫柔以待”,以免細胞全被洗沒了。] ,加入低濃度血清培養基(如1% FBS)[使用低濃度的培養基是為了防止細胞增殖對劃痕結果的影響] ,0 h拍照。

        清洗

        低濃度血清培養基培養

        (5)   37℃、5% CO2培養箱培養,根據愈合程度選擇合適時間用細胞成像設備掃板。

        (6)   分析遷移面積。

        四、劃痕數據分析概述

        遷移面積=x h的細胞面積-0 h的細胞面積。


        五、吉凱劃痕數據分析步驟[不同的細胞成像設備使用不同的分析方法,八仙過海各顯神通吧,但是整體思路就是比面積、比寬度

        (1)   在0 h和x h對目標96孔板進行掃描讀板,獲得掃描圖片;

        下圖為針對同一視野在遷移0 h和20 h后獲得的掃描圖像示例(細胞為H1299):

        (2)   用YOKOGAWA CQ1激光共聚焦細胞分析儀或者帶有分析功能的倒置顯微鏡(吉盛醫學提供)對掃描圖片進行分析,自動獲得數據獲得細胞面積。         


        (3)   計算遷移面積=(S3+S4)-(S1+S2)

        (4)   針對劃痕預實驗,根據遷移面積,判斷細胞是否有愈合能力;針對劃痕實驗,根據遷移面積,判斷相對陰性對照組,KD(或OE)組細胞愈合能力的差異。

                    

               CQ1 活細胞共聚焦顯微鏡 (吉盛醫學提供)      NIB倒置活細胞熒光顯微鏡(吉盛醫學提供)        

        六、質量控制:

        1、 正式實驗每個孔采集3張照片,照片要求劃痕寬度基本一致,且劃痕的面積內無遺留較多的細胞或者痕跡,圖片中的細胞分布均勻,且無大面積的凋亡(靶點本身導致的凋亡除外);

        2、 如果在實驗中設置了CON(空白)組,實驗中CON和NC(陰性對照)組的遷移能力要基本一致;

        3、 細胞劃痕預實驗基本從8h,16h,24h,36h,48h這幾個時間點間進行選擇,但是具體進行的時間點需要根據細胞的遷移能力進行調整;報告中的圖片不能在第1和第2個時間點就出現愈合。



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