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        microRNA過表達慢病毒載體構建服務
        microRNA過表達慢病毒載體構建服務
         
        MicroRNA簡介:
          MicroRNA(miRNA)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,是發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。其在細胞內具有多種重要的調節作用。每個miRNA可以有多個靶基因,而幾個miRNAs也可以調節同一個基因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達,也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。據推測,miRNA調節著人類三分之一的基因。
        MicroRNA有以下幾種形式:
            pre-miRNA
            約70bp含microRNA莖環結構的pre-miRNA。
            primiRNA
            天然primiRNA :從染色體基因文庫中調取300bp-1000bp完整的microRNA基因,克隆到質粒載體(普通載體或病毒載體),以強大的CMV啟動子操 縱該300bp-1000bp microRNA。
            人工primiRNA 選擇一個完整的microRNA基因,克隆到質粒載體(普通載體或病毒載體)。以人工合成的約70bp含miRNA莖環結構的目標pre-RNA替代原pre-RNA,并以pol Ⅱ/pol III 啟動子操縱該microRNA結構單元。
         
          pre-miRNA是最早采用的microRNA,擁有大量的成功報道;瘜W合成的pre-miRNA制備快捷,可以標記熒光等追蹤。缺點是制備的RNA穩定性較差,而且,由于制備的microRNA較長,合成時RNA的錯誤難以避免(當合成RNA超過60bp時,出現一個堿基錯誤率約30%),轉錄制備的pre-miRNA穩定性較好,但無flank結構,很少使用。質粒載體形式的pre-miRNA也因為發現microRNA的flank對于microRNA功能和測定非常重要,現已逐漸被pri-miRNA取代。人工pri-miRNA效果較pre-miRNA好,也有足夠多的成功使用的經驗報道,但這種人工microRNA采用固定的mir155 flank,制備的microRNA功能不及天然原始microRNA,故也逐漸較少使用。原始天然pri-miRNA克隆自天然文庫的microRNA由于保留了每個microRNA獨自的原始天然雙臂結構,效果更好,是近來被首選方法。
         
         
         
         
        MicroRNA過表達慢病毒載體特點:
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
        我們采用美國進口的第三代microRNA過表達慢病毒表達載體,有HIV來源的和FIV來源兩種,能夠高效表達出原始天然pri-miRNA和MicroRNA基因簇,詳情請參見慢病毒載體信息,我們的microRNA過表達慢病毒載體具有以下特點:
         
         
         
         
        一、CMV啟動子高效表達出原始天然pri-miRNA,我們從人、大鼠、小鼠基因組或腫瘤組織中克隆出pri-miRNA,完全忠實細胞內的天然結構,具有更高的效率,更重要的是,它能在細胞內準確無誤地表達出天然microRNA。
        載體表達出的pri-miRNA結構:
         
         
        二、著成千上萬條miRNA被鑒定出來,用microRNA干預基因功能或藥物篩選的需求越來越多。由于microRNA慢病毒載體能夠被包裝成microRNA慢病毒顆粒,用于感染分裂期和非分裂期細胞,如原代細胞、難于轉染的細胞或干細胞等,使其成為活體研究甚至基因治療的里程碑。
         
        三、microRNA慢病毒載體經可包裝成慢病毒顆粒,microRNA慢病毒感染過的細胞能夠長久表達miRNA,且這種表達具有可遺傳性,與化學合成的miRNA或表達miRNA質粒實現的瞬時表達相比,這種特點與天然的microRNA機制更相似。
         
        四、copGFP與miRNA前體共同表達,可用于陽性細胞流式篩選與鑒定。
         
        五、構建的載體可以含有完整MiRNA基因簇,可用于高通量表型篩選研究。
         
        六、含有多種優勢元件:
               3 ΔLTR (ΔU3)
               3’ LTR區域刪除了U3,使其不再有啟動/增強活性,成為自滅活(self-inactivating, SIN) 載體,即整合到細胞基因組后,不會產生新的子代病毒,也降低了對周圍基因的意外激活。
               copGFP
        綠色熒光報告基因,與常用的EGFP類似,但熒光更亮。
               Zeo抗性基因
        陽性細胞篩選。
               pUC起始點
        使質粒在 E.coli 中高密度拷貝并且保持穩定。
               RSV/5’LTR RSV雜交啟動子-R/U5’長末端重復序列
        讓全長病毒在293前體細胞中高水平包裝和轉錄表達。
               CMV/5’LTR CMV雜交型啟動子-R/U5長末端重復序列)
        使慢病毒載體保持高水平轉錄和高效轉錄出含病毒包裝必需功能元件(如Psi, RRE, and cPPT等)的轉錄本,當用病毒包裝細胞系(如HEK 293細胞)包裝病毒時也能表達病毒衣殼蛋白。
               SV40起始點
        使質粒在哺乳動物細胞中穩定復制。
               SV40多聚A加尾信號
        強制轉錄終止子,有效終止轉錄或者終止共轉錄過程,維持穩定態mRNA高水平表達。
               LCS無連接酶克隆位點
        不依賴多克隆位點,能將各種目的microRNA插入載體,不需要DNA鏈接酶,較常規方法可靠。
               WPRE元件
        增強CMV啟動轉錄的穩定性。
         
        說明:每種載體用的優勢元件均有所不同 
          
        客制化服務方案:
                     
          目前我們能夠為客戶提供包括miRNA表達譜分析、慢病毒載體構建、測序、慢病毒生產等一站式服務。我們的服務將為客戶最大限度地提高效率和節省時間。另外,我們的技術專家將為您的實驗提供全程支持,請Email至yanggy@genechem.com。
          同時,我們為客戶提供miRNA過表達慢病毒載體構建服務的個性化定制服務方案,包括根據miRNA特征、目的細胞特征與客戶需求,我們會為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動子、熒光標記或選擇性抗性標記,插入pri-miRNA或miRNA基因簇使其過表達,客戶也可以根據我們的載體信息自行挑選;同時又可以根據客戶的需要,可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因或標簽(或進行改造),從而構建miRNA過表達慢病毒載體。
          我們有標準的客制化服務流程,同時我們也會根據客戶需求,為每個客戶度身定制各種MicroRNA慢病毒載體構建服務方案。如有需要,歡迎致電021-34512321咨詢。
         
         
        標準客制化服務流程:
         
        microRNA過表達載體構建服務列表:
         
          我們可以根據客戶需求構建各種濃度的超純純化miRNA過表達慢病毒載體,能被包裝成miRNA過表達慢病毒顆粒;無內源性多聚A信號;對靶細胞無毒;從5 to 3 LTR序列大小大于8kb;可直接轉染細胞,用于瞬時轉染;也可以包裝成病毒顆粒,用于穩定長效表達。
         
        超純純化標準:
                           內毒素<10EU/mg質粒DNA
                           RNA<0.2ug/mg
                           基因組DNA<2ug/mg
                           蛋白<3ug/mg 
         
              編號
        cDNA過表達慢病毒載體構建
        標準
        工作日
        C200001
        10 μg
        超純純化
        10
        C200002
        20 μg
        超純純化
        10
        C200003
        40 μg
        超純純化
        10
         
         
         
         
         
         
         
         
        表達出的MicroRNA是內源性MicroRNA的幾倍:
          用HIV來源的慢病毒載體構建的MicroRNA Lenti-miR載體包裝成病毒顆粒之后,感染HEK293細胞,表達的MicroRNA用qPCR檢測,結果發現用我們的過表達載體表達出MicroRNA是內源性MicroRNA的幾倍以上。
         
          
        共表達microRNA基因簇:
          microRNA(miRNA)基因簇是一類miRNA基因在染色體上成簇排列形成的基因群. 在動植物基因組中,已發現存在大量簇生排列的miRNA基因。然而這種簇生排列方式所具有的功能意義尚不完全清楚. miRNA基因簇常位于一個多順反子內, 通過共表達在胚胎發育、細胞周期、腫瘤發生、細胞分化等諸多方面發揮協同調控的功能。
          詳細的構建服務流程及其他信息請見上述microRNA慢病毒載體構建服務內容。
         
        腫瘤和干細胞MicroRNA基因簇:
         
         
        乳腺癌腫瘤干細胞MicroRNA基因簇:
         
         
         
        成功案例:
         
        miR-10b construct cloned using Clone-it microRNA Cloning System was transiently transfected into 293 cells with the indicated amount of plasmid DNA.  Mature miR-10b was measured using qPCR
          
         
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