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          產品編號: 產品名稱:    
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        shRNA慢病毒包裝服務
        shRNA慢病毒包裝服務
         
        一、慢病毒包裝服務介紹:      
         
               我們采用第三代慢病毒載體系統(詳見慢病毒載體信息),病毒顆粒包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus)的VSV-G蛋白,使病毒能感染更多種細胞(包括分裂、非分裂細胞、難以轉染的細胞)、模式動物、活體實驗,且表達更趨穩定。
         
        shRNA慢病毒載體,最給力的RNAi工具:
         
          在siRNA表達載體中,構成siRNA的正義與反義鏈,可由各自的啟動子分別轉錄,然后兩條鏈互補結合形成siRNA; 也可由載體直接表達發卡結構小干擾RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通過構建RNAi慢病毒顆粒制備shRNA,已成為進行RNA干擾實驗的最常用手段之一。
         目前為了感染原代細胞和難感染的細胞系或者在動物水平進行RNAi,研究科學家更多的選擇了慢病毒載體。利用shRNA慢病毒載體,與化學合成的siRNA和基于瞬時表達載體構建的shRNA相比,一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用,另一方面,shRNA慢病毒顆?捎糜诟腥疽揽總鹘y轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞,并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組,進行長時間的穩定表達。
         
        shRNA慢病毒顆粒具有以下優勢:
        轉染效率高且可以轉導入絕大多數細胞
        shRNA慢病毒能用于分化細胞或靜息型哺乳動物細胞的轉染,包括難于轉染的原代細胞、干細胞、神經細胞和內皮細胞等,另外,我們的載體也可以用于knockdow動物和轉基因小鼠。
        更好地分析目的基因的特點
        與化學合成的siRNA相比, 利用shRNA慢病毒轉染細胞后能夠避免合成的siRNA非有效轉染造成的殘余和損傷。慢病毒帶來的高效和無壓力轉染極大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。
        長久性與可遺傳型RNA干擾
        shRNA慢病毒感染細胞后可以整合到受感染細胞的基因組,穩定長效表達miRNA, 這種RNA干擾具有可遺傳性,以便用于篩選穩定細胞模型用于長期的研究和觀察。
         
        慢病毒包裝簡要流程:
        1、根據目的基因相關信息構建shRNA重組慢病毒載體,提取和純化成超純純化重組質粒;
        2、使用重組載體和病毒包裝質粒共轉染293TN 細胞,培養48 -72小時左右,進行病毒包裝和生產,收集病毒液;
        3、純化和濃縮病毒液;
        4、病毒滴度測定、目的基因檢定
         
        慢病毒轉染效率:
         
          MOI(Multiplicity of Infection,感染復數)是指每個細胞感染的病毒數,通常MOI越高,病毒整合到染色體的數量以及目的蛋白的表達量越高。 對于分裂活躍的細胞,比如Hela、293細胞,MOI=1時,80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞,比如原代細胞,感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI(比如0、1、5、10、50、100等),選擇適合的MOI進行實驗。
         
         
        高度安全:
         
          我們的慢病毒顆粒將生物安全性保證到了最大程度,其中HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國臨床基因治療的慢病毒, 專利號位美國Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。
         
        ΔLTR (ΔU3)
        3’ LTR區域刪除了U3,使其不再有啟動/增強活性,成為自滅活(self-inactivating, SIN)載體,即整合到細胞基因組后,不會產生新的子代病毒,也降低了對周圍基因的意外激活。
        RSV/5LTR RSV雜交啟動子-R/U5長末端重復序列)
        采用雜合型RSV的增強子/啟動子-R/U5’長末端重復序列,這樣病毒轉錄時不依賴tat的存在,去除了 HIV的tat基因表達。,tat在HIV-1基因組復制和轉錄延伸過程中發揮重要作用
        慢病毒骨架設計
        僅保留了三個HIV-1病毒包裝、復制與轉導必需基因(gag, pol, rev) ,因其缺乏HIV­-1增強子啟動子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出HIV RNA
        慢病毒顆粒中無HIV-1基因
        因為HIV-1表達的包裝質粒都缺乏包裝信息,所以,慢病毒顆粒不具有復制能力
        假病毒顆粒
        慢病毒顆粒實為假病毒顆粒,只表達目的基因
        水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
        限制慢病毒成為野生型的可能性
         
         
        二、我們的服務優勢:
         
        客制化載體構建方案:
         
          我們的服務方案包括根據目的基因特征以及要轉染細胞的特征與客戶需求,我們會為客戶選擇最合適的慢病毒載體、啟動子、熒光標記或選擇性抗性標記,插入目的基因使其過表達,客戶也可以根據我們的載體信息自行挑選;同時又可以根據客戶的需要,可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因或標簽(或進行改造),從而構建高質量的shRNA慢病毒載體,請參見shRNA慢病毒載體構建服務。
         
        多種慢病毒載體系統可供選擇:
          我們用于shRNA慢病毒載體至少有十種以上可供客選擇,根據參考文獻以及目的應用,我們總能幫客戶找到最合適實驗目的的載體系統,而且每種慢病毒載體都具有相應的文獻可追溯性(請參見慢病毒載體信息)。
         
        更合理、省心的服務流程:
         
          我們會根據每個客戶的情況,為客戶獨身定制相應的的服務流程,相比較而言,我們會根據客戶的實驗目的,查閱大量的文獻以作參考;大規模包裝之前,會先小試,再在細胞水平驗證目的基因, 并且會跟客戶確認,讓技術服務更合理;客戶只需要告訴我們目的序列信息和細胞信息,我們會完成所有的服務,最后也提供相應的數據和資料,讓客戶更省心。
           我們有以下標準服務方案如下,但是具體的實驗方案需要根據實際情況而定制,這里的標準流程僅供參考:
         
         
        慢病毒濃縮:
         
          我們使用SBI公司的PEG-it不會積累細胞殘片,避免了毒性和免疫反應,對包括ES細胞在內的所有靶細胞無毒。超速離心的過程中,也會濃縮其他雜質,如細胞碎片、膜片段、以及細胞培養基內的變性蛋白等。這些雜質對于病毒顆粒的后繼操作是有害的,如降低細胞轉染效率,對轉染細胞的細胞毒性等,特別是當轉染原代細胞的時候。同時應用于試驗動物的時候,會引發免疫反應,因此在慢病毒的應用過程中,不但需要較高的滴度,較高的純度也是很重要的。
         
         
        慢病毒包裝服務儲存計劃:
         
        我們會為客戶將定制好的慢病毒顆粒及載體做額外備份,免費儲存一段時間。以免客戶在后面的實驗中發生意外而急需。如有需要,也可以更優惠的價格再次訂購。,詳情請參見慢病毒包裝服務儲存計劃。
         
        技術力量:
         
               我們的主要生產人員均為博士后或博士,我們生產人員常規包裝的慢病毒包裝顆粒滴度均在>10^9 IFUs/ml以上。
         
         
         
         
        三、cDNA過表達慢病毒包裝服務列表:
         
         
        cDNA過表達慢病毒包裝服務列表:
         
        編號
        慢病毒產量
        可提供慢病毒數量
        工作日
        P200001
        >1*10^7  IFUs/ml(常規滴度)
        >1*10^ 7~8 IFUs/ml
        30
        P200002
        >5*10^7 IFUs/ml(常規滴度)
        >5*10^ 7~8 IFUs/ml
        30
        P200003
        >1*10^8 IFUs/ml(高滴度)
        >1*10^ 8~9 IFUs/ml
        30
        P200004
        >2*10^8 IFUs/ml(高滴度)
        >2*10^ 8~9 IFUs/ml
        30
        P200005
        >4*10^8 IFUs/ml(高滴度)
        >4*10^ 8~9 IFUs/ml
        30
        P200006
        >1*10^9 IFUs/ml(超高滴度,體內實驗、干細胞應用)
        >1*10^ 9~10 IFUs/ml
        30
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
        說明:FIV來源的載體只能包裝成常規滴度的慢病毒
         
        對照慢病毒顆粒:
         
        服務編號
        對照慢病毒產量
        可提供慢病毒數量
        P200007
        >1*10^7 IFUs/ml(常規滴度)
        >1*10^ 7~8 IFUs/ml
        P200008
        >1*10^8 IFUs/ml(常規滴度)
        >1*10^ 8~9 IFUs/ml
        P200009
        >1*10^9 IFUs/ml(超高滴度,體內實驗、干細胞應用)
        >1*10^ 9~10 IFUs/ml
         
         
         
         
         
         
         
        *用cDNA過表達病毒顆粒做對照,請詳見cDNA基因過表達慢病毒包裝服務。
         
        編號
        shRNA慢病毒載體陰性對照
        標準
        主要特征
        S200008
        pGreenPuro Scramble Hairpin Control
        10 μg超純純化
        GFP和Puro雙標簽
         
         
         
         
         
         
        四、成功案例與參考文獻:
         
        成功案例:
         
        HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.
         
        參考文獻:
         
        1、Tomlinson JJ, Boudreau A, Wu D, Abdou Salem H, Carrigan A, Gagnon A, Mears AJ, Sorisky A, Atlas E, Haché RJ. Insulin sensitization of human preadipocytes through glucocorticoid hormone induction of forkhead transcription factors. Mol Endocrinol. 2010 Jan;24(1):104-13.
        4、Thal D, Xavier CP, Rosentreter A, Linder S, Friedrichs B, Waha A, Pietsch T, Stumpf M, Noegel A, Clemen C. Expression of coronin-3 (coronin-1C) in diffuse gliomas is related to malignancy. J Pathol. 2008 Mar;214(4):415-24.
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        9、Lee J.-J., Chen P. B., Yang S.-H., Cheng C.-H., Chueh L.-L., Pang V. F., Michael Hsiao M., Lin C.-T. Effect of the VP3 gene of chicken anemia virus on canine mammary tumor cell. American Journal of Veterinary Research 68 (4): 411-422, 2007.
        11、Stefano Bartesaghi, Joanne Betts-Henderson, Kelvin Cain, David Dinsdale, Xiaoshan Zhou, Anna Karlsson, Paolo Salomoni1 and Pierluigi Nicotera.Loss of thymidine kinase 2 alters neuronal bioenergetics and leads to neurodegeneration. Hum Mol Genet. 2010 May 1;19(9):1669-77. PDF>>>
        13、Yonghui Zhang, Xiaojing Lin, Guoqin Wang, Jianfang Zhou, Jian Lu, Honglan Zhao, Fengwei Zhang, Jia Wu, Chunqiong Xu, Ning Du, Zi Li, Ye Zhang, Xiaoyi Wang, Shengli Bi, Yuelong Shu, Hongning Zhou, Wenjie Tan, Xiaobing Wu, Zhihui Chen, Yue Wang. Neuraminidase and Hemagglutinin Matching Patterns of a Highly Pathogenic Avian and Two Pandemic H1N1Influenza A Viruses. PLoS One. 2010; 5(2): e9167. PDF>>>
        14、Ning Sun, Nicholas J. Panetta, Deepak M. Gupta, Kitchener D. Wilson, Andrew Lee, Fangjun Jia, Shijun Hu, Athena M. Cherry, Robert C. Robbins, Michael T. Longaker, and Joseph C. Wu. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 September 15; 106(37): 15720–15725. PDF>>>


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