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        • MR SOLUTIONS 小動物核磁共振活體成像系統
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        shRNA慢病毒載體構建服務
        shRNA慢病毒載體構建服務
         
        shRNA慢病毒載體,最給力的RNAi工具:
              
          在siRNA表達載體中,構成siRNA的正義與反義鏈,可由各自的啟動子分別轉錄,然后兩條鏈互補結合形成siRNA; 也可由載體直接表達發卡結構小干擾RNA (small hairpin RNA, shRNA)。通過構建RNAi慢病毒表達載體制備shRNA,已成為進行RNA干擾實驗的最常用手段之一。
          目前為了感染原代細胞和難感染的細胞系或者在動物水平進行RNAi,研究科學家更多的選擇了慢病毒載體。利用慢病毒構建的shRNA載體,與化學合成的siRNA和基于瞬時表達載體構建的shRNA相比,一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用,另一方面,lentivirus-shRNA克隆經過慢病毒包裝系統包裝后,可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞,并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組,進行長時間的穩定表達。
         
        shRNA慢病毒載體具有以下優勢:
         
        轉染效率高且可以轉導入絕大多數細胞
          shRNA慢病毒載體能用于分化細胞或靜息型哺乳動物細胞的轉染,包括難于轉染的原代細胞、干細胞、神經細胞和內皮細胞等,另外,我們的載體也可以用于knockdow動物和轉基因小鼠。 
        更好地分析目的基因的特點
          與化學合成的siRNA相比, 利用慢病毒構建的shRNA載體轉染細胞后能夠避免合成的siRNA非有效轉染造成的殘余和損傷。慢病毒帶來的高效和無壓力轉染極大提高了目的基因沉默后表型分析的likelihood值。  
        長久性與可遺傳型RNA干擾
          包裝成慢病毒后感染細胞,可以整合到受感染細胞的基因組,穩定長效表達miRNA, 這種RNA干擾具有可遺傳性,以便用于篩選穩定細胞模型用于長期的研究和觀察。
         
         
        shRNA慢病毒載體特點:
         
          我們采用的美國進口第三代HIV或FIV來源的慢病毒載體屬于自我滅活型載體,在長效穩定表達siRNA的同時又能保證高度安全,詳情請參見慢病毒載體信息,我們的shRNA慢病毒載體優勢有:
        1、含有H1/U6 RNA聚合酶Ⅲ啟動子的HIV慢病毒載體保證能包裝出高滴度的慢病毒;
        2、RNA單啟動子系列高效表達shRNA,而RNA雙啟動子直接表達雙鏈siRNA;
        3、通T2A肽鏈linker基因同時表達GFP和Puro兩個標簽,后續細胞篩選更容易;
        4、多種能表達報告基因的啟動子、含多個MSC位點或LCS無連接酶克隆位點、多種報告基因及抗性基因,選擇更靈活;
        5、載體信息具有可追溯性,每種載體都具有對應的國外參考文獻及數據,便于文獻發表;
         
        高效且安全:
           
          HIV-1來源的pSIH系列shRNA慢病毒載體來源于能用于美國臨床基因治療的慢病毒, 專利號為美國Dr. J. G. Sodroski 的US patent #5,665,577 和 #5,981,276。 所以,我們的shRNA慢病毒載體將生物安全性保證到了最大程度,是因為:
         
        U6H1  RNA啟動子
        U6和H1 RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子,其特點是啟動子自身元素均位于轉錄區的上游,適合于表達~21ntRNA莖環結構(stem loop)。
         
        ΔLTR (ΔU3)
        3’ LTR區域刪除了U3,使其不再有啟動/增強活性,成為自滅活(self-inactivating, SIN)載體,即整合到細胞基因組后,不會產生新的子代病毒,也降低了對周圍基因的意外激活。
         
        RSV/5LTR RSV雜交啟動子-R/U5長末端重復序列)
        采用雜合型RSV的增強子/啟動子-R/U5’長末端重復序列,這樣病毒轉錄時不依賴tat的存在,去除了HIV的tat基因表達。,tat在HIV-1基因組復制和轉錄延伸過程中發揮重要作用。
         
        結構設計
        僅保留了三個HIV-1病毒包裝、復制與轉導必需基因(gag, pol, rev) ,因其缺乏HIV­-1增強子啟動子序列,即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出HIV RNA 。
         
        慢病毒顆粒中無HIV-1基因表達
        因為HIV-1表達的包裝質粒都缺乏包裝信息,所以,慢病毒顆粒不具有自我復制能力。
         
        假病毒顆粒
        慢病毒顆粒實為假病毒顆粒,只表達目的基因。
         
        水皰性口炎病毒(VSV)糖蛋白G包膜
        限制病毒成為野生型的可能性。
         
        說明:詳情請參見慢病毒載體信息
         
         
        客制化服務方案:
           
          目前我們能夠為客戶提供包括RNAi靶序列設計、慢病毒載體構建、測序、慢病毒生產等一站式服務,我們的服務將為客戶最大限度地提高效率和節省時間。另外,我們的技術專家將根據客戶提供背景資料共同探討服務的可行性和技術路線,請Email至yanggy@genechem.com.cn.
           
          同時,我們為客戶提供shRNA慢病毒載體構建服務的個性化定制服務方案:
        1、根據目的mRNA序列,我們的專業人士使用專業siRNA設計軟件,為客戶設計出3-4條 RNA干擾靶序列,或根據客戶需求,設計更多RNAi靶序列;
        2、針對不同的靶細胞,不同的病毒載體感染效率有差別。我們會幫客戶先進行預試和篩選出最合適的載體,客戶也可以根據經驗自行挑選出合適的載體;
        3、可以根據客戶的需要,可在重組慢病毒載體中加入各種報告基因、各種抗性標簽或進行改造,從而構建shRNA慢病毒載體。
          雖然我們有標準的客制化服務流程,但是我們會根據客戶需求,為每個客戶度身定制各種shRNA慢病毒載體構建服務方案。如有需要,歡迎致電021-34512321 咨詢。
         
         
        標準客制化服務流程:
         
         
        shRNA慢病毒載體構建服務列表:
           
          我們可以根據客戶需求構建4條以上的RNAi靶序列以及其各種濃度的超純純化shRNA慢病毒載體。構建的重組shRNA慢病毒載體可直接轉染細胞,用于瞬時轉染;也可以包裝成病毒顆粒,用于shRNA的穩定長效表達。
         
        超純純化標準:
             內毒素<10EU/mg質粒DNA
             RNA<0.2ug/mg
             基因組DNA<2ug/mg
             蛋白<3ug/mg
         
        編號
        shRNA慢病毒載體構建
        標準
        工作日
        S200001
        1-3條靶序列
        每種10 μg超純純化
        10
        S200002
        1-3條靶序列
        每種20 μg超純純化
        10
        S200003
        1-3條靶序列
        每種40 μg超純純化
        10
        S200004
        4-10條靶序列
        每種10 μg超純純化
        15
        S200005
        4-10條靶序列
        每種20 μg超純純化
        15
        S200006
        4-10條靶序列
        每種20 μg超純純化
        15
        S200007
        10條靶序列以上
        請咨詢
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        質量保證:
          
          您購買一套克。ㄡ槍σ粋基因的不同位置設計3-4條RNAi靶序列), 在轉染效率>80%的前提下,我們保證至少有1-2個載體有效(可以達到至少70%轉錄水平的RNA干擾)。
         
         
        shRNA慢病毒載體陰性對照: 
        編號
        shRNA慢病毒載體陰性對照
        標準
        主要特征
        S200008
        pGreenPuro Scramble Hairpin Control
        每種10 μg超純純化
        GFP和Puro雙標簽
         
         
        成功案例:
        HEK-293 cells were transfected with either pSIH1-H1-copGFP or pGreenPuro™ shRNA expression vector, and puromycin (8 – 50 ug/ml final concentration) was then added to the cells 24 hours after transfection. The pictures were taken 24 hour after the initiation of the puromycin treatment.
         
         
        參考文獻:
         
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